Analýza obsahu alkoholu v krvi pomocí nosného plynu dusíku

Řada zemí má v tomto ohledu k alkoholu nulovou toleranci, ale ve většině zemí světa platí limit mezi 50 a 80 mg alkoholu na 100 ml krve, tedy 0,05-0,08 %. Výsledky chromatografického stanovení se předkládají u soudu k potvrzení kvantitativních hodnot BAC, což z něj činí jednu z nejčastěji praktikovaných toxikologických analýz ve forenzních laboratořích. Vzhledem k velkému objemu vzorků a požadavku na jejich okamžité zpracování je třeba analýzu provést rychle a přitom neztrácet na přesnosti a spolehlivosti.

Pro BAC analýzy se obvykle používá headspace GC s FID detekcí. Headspace GC umožňuje kvantitativní analýzu alkoholu přímo ze vzorků krve. Standardní headspace systémy používají k tlakování vialek dusík a jako nosný plyn GC se obvykle používá helium. Tento aplikační list se zabývá použitím dusíku jak pro tlakování vialek, tak pro nosný plyn GC. Dusík nabízí levnější, hojně rozšířenou alternativu k heliu, přičemž poskytuje podobný chromatografický výkon. V článku rozebereme analýzu skutečných forenzních vzorků krve odebraných řidičům podezřelým z řízení pod vlivem alkoholu, analyzovaných s použitím dusíku a helia.

Příprava vzorků

Pomocí ředicího přístroje Hamilton Microlab 600 bylo alikvotováno 200 µl kalibrátorů, kontrolních vzorků nebo vzorků krve a dávkováno s 2000 µl roztoku vnitřního standardu do 10ml headspace vialky. Interní roztok se skládal z 0,03 % (v/v) n-propanolu/ 1M síranu amonného/ 0,1 M hydrogen siřičitanu sodného. Jako kalibrátory byly použity stopové, vodné ethanolové NIST roztoky, od společností Cerilliant a Lipomed (10, 50, 80, 200, 300, 500 mg/dl). V patřičných ředěních pak byly dané vzorky použity jako vzorky kontrolní (20, 80, 400 mg/dl).

Experimentální část

Analýzy byly provedeny pomocí plynového chromatografu Agilent 7890B se split/splitless inletem a dvěma kolonami, z nichž každá byla připojena k detektoru FID. Vzorky se na kolony rozdělovaly pomocí neproplachovaného rozdělovače toku Agilent Capillary Flow Technology. GC byl spojen s headspace dávkovačem Agilent 7697A. Tlak plynu v lahvičkách pro všechny zkoušky zajišťoval generátor dusíku Peak Scientific Precision. Nosný plyn byl zajištěn buď héliovou lahví, nebo taktéž generátorem dusíku Precision Nitrogen Generator. Provozní nastavení systému HS-GC-FID je uvedeno v tabulce 1.

Altium: Tabulka 1 - Provozní podmínky HS-GC-FID

Pro analýzu byl použit software Agilent MassHunter GC/MS Acquisition a MSD ChemStation Enhanced Data Analysis E.02.02.1431.

Výsledky

Kalibrační křivky vytvořené s héliem a dusíkem jako nosnými plyny vykazovaly velmi dobrou linearitu, přičemž obě křivky měly hodnoty R2 99,9999.

Bylo měřeno 5 vzorků alkoholu v krvi. Obrázky 2 a 3 ukazují chromatogramy z kolon DB-ALC1 a DB-ALC2 pro separaci a pořadí eluce analytů vícesložkové rozlišovací směsi při použití nosného plynu dusíku a helia. Separace potenciálně interferujících složek, jako jsou methanol a 2-propanol, bylo dosaženo do 3 minut při použití obou nosných plynů (obr. 2 a obr. 3).

Altium: Obrázek 2 - Výsledky rozlišení směsi na koloně DB-ALC1 při použití dusíku a helia jako nosného plynu

Altium: Obrázek 3 - Výsledky rozlišovací směsi na koloně DB-ALC2 s použitím dusíku a nosného plynu helia

Výsledky analýz skutečných vzorků krve (analyzovaných ve dvou opakováních) provedených na obou nosných plynech, dusíku i heliu, poskytly rovnocenné výsledky, přičemž nebyly zjištěny žádné rozdíly ve vypočtených koncentracích ethanolu (tabulka 2).

Altium: Tabulka 2 - Výsledky analýzy alkoholu v krvi z analýzy provedené jak s dusíkem, tak s héliem

Z pěti testovaných vzorků krve měl jeden hodnotu vyšší než 0,2 %, což by téměř ve všech zemích světa vedlo k zákazu řízení. Dva vzorky měly více než 0,05 %, což by v řadě zemí vedlo k zákazu řízení. Další dva vzorky měly hodnotu 0,014 % a 0,023 %, což by bylo pod limitem ve většině zemí světa.

Závěry

Výsledky analýzy BAC ukazují, že volba nosného plynu nijak neovlivňuje linearitu kalibrační křivky nebo vypočtený obsah etanolu ve vzorcích krve. Vzhledem k tomu, že dusík je levnou a dobře dostupnou alternativou k heliu, není důvod, proč jej nevyužívat pro analýzu BAC místo helia. Dusík se často používá taktéž pro tlakování vialek v headspace dávkovačích, čili jej lze v této aplikaci s výhodou použít jako společného plynu pro tlakování vialek, nosný plyn a make-up plyn pro FID. Dusíkový generator řady Precision Nitrogen je ideálním zdrojem provozních plynů této aplikace a můžete jej skombinovat i s modely Precision Hydrogen a Precision Zero Air, které Vám zajistí zdroj palivového vodíku a nulového vzduchu pro plamen FID detektoru.

Ed Connor Dr. Sc. je produktový specialista na GC ve společnosti Peak Scientific, Inchinnan Business Park, Skotsko, Velká Británie. Před nástupem do společnosti Peak v únoru letošního roku Ed absolvoval doktorandské studium na ETH Zurich ve Švýcarsku.

Doktor Greg Dooley je ředitelem laboratoře analytické toxikologie na Coloradské státní univerzitě. Jeho výzkum zahrnuje vývoj analytických metod využívajících nejmodernější přístrojové vybavení k měření analytů, které jsou předmětem zájmu pro současné forenzní a analytické toxikologické aplikace.