Postupy předúpravy vzorků pro bioanalytické analýzy

Vzhledem ke své povaze vyžadují bioanalytické vzorky často předběžnou úpravu před dalším čištěním pomocí extrakce na pevné fázi (SPE). Každá matrice vzorku představuje své specifické výzvy, jako je odstranění bílkovin z plazmy a séra, rozklad červených krvinek v celé krvi, hydrolýza glukuronidovaných analytů v moči a homogenizace tkáňových vzorků. Tato technická poznámka popisuje běžné postupy předúpravy bioanalytických vzorků.

Plazma/sérum

Předúprava plazmy a séra závisí na povaze analytu. Pokud je analytem kyselina, lze k narušení interakce léčiva s bílkovinami použít 2% kyselinu fosforečnou (20 µl 85% H₃PO₄ na 1 ml plazmy nebo séra). Pokud je analyt zásaditý, použije se 0,1 M hydroxid sodný. Po přidání kyseliny nebo zásady se vzorek promíchá na vortexu po dobu 20–30 sekund a poté odstředí. Supernatant je poté připraven k další analýze.

Celá krev

Pro celou krev existuje několik možných předúprav. Pokud je cílový analyt přítomen v červených krvinkách, je nezbytný krok hemolýzy.

• Hemolýza: K 0,2 ml celé krve (s analytickým standardem a vnitřním standardem) ve zkumavce o objemu 1,2 ml přidejte 400 µl 2% roztoku síranu zinečnatého/80% methanolu. Promíchejte na vortexu 10–20 sekund a centrifugujte při 14 000 ot./min po dobu 10 minut. Supernatant odeberte k další analýze.
  Příprava roztoku síranu zinečnatého/methanolu: Do 100ml odměrné baňky přidejte 20 ml vody a 3,6 g ZnSO₄·7H₂O. Po rozpuštění přidejte 100% methanol. Roztok uchovávejte při 2–8 °C po dobu až 7 dnů.
• Osmotický rozklad: Do 1 ml celé krve přidejte vnitřní standard a 4 ml destilované vody. Promíchejte/vortexujte a nechte stát 5 minut. Centrifugujte při 670 × g po dobu 10 minut a peletu zlikvidujte. pH supernatantu upravte přidáním pufru.
• Sonikace: Sonikujte 1 ml celé krve po dobu 15 minut při pokojové teplotě. Přidejte 3–6 ml vhodného pufru (např. fosfátového). Promíchejte/vortexujte, nechte stát 5 minut a centrifugujte při 670 × g po dobu 15 minut. Supernatant analyzujte.

Poznámka: Srovnání výše uvedených předúprav bylo provedeno pro kyselé, zásadité i neutrální léčiva. Nejvyšší výtěžnosti byly dosaženy při zředění vzorku pufrem a použití fyzikální denaturace (sonikace) oproti chemickým metodám. Sonikace účinně narušuje buněčné membrány, a pokud je dodržen uvedený protokol, nedochází k ucpávání.

Sliny

U vzorků ústních tekutin není nutná hydrolýza a lze aplikovat obecný protokol používaný pro plazmu/sérum.

Moč

V případě konjugovaných forem analytu (např. sulfátové nebo glukuronidové) je nutná enzymatická hydrolýza. Ta vyžaduje specifické pH (4–5) a teplotu. Lze také použít kyselou nebo zásaditou hydrolýzu v závislosti na stabilitě analytu.

• Enzymatická hydrolýza: K 500 µl vzorku (s analytickým a vnitřním standardem) přidejte 100 µl kyselého pufru (viz níže) a 20 µl β-glukuronidázy. Vortexujte 5–6 sekund, inkubujte ve vodní lázni při 63 °C po dobu 30 minut. Přeneste do 96jamkové destičky nebo vialky pro autosampler, uzavřete a centrifugujte 10 minut při 2 000 ot./min.
  Příprava kyselého pufru: (1,0 M octanový pufr, pH 4,0):
  Rozpusťte 3,0 g ledové kyseliny octové a 4,1 g octanu sodného v 1l odměrné baňce.
• Zásaditá hydrolýza: K 1 ml moči (s analytickým a vnitřním standardem) přidejte 100 µl 10 N KOH. Promíchejte, vortexujte a nechte hydrolyzovat 20 minut při 60 °C. Ochlaďte a upravte pH na 3,5–4,0 přidáním 200 µl ledové kyseliny octové.
• Kyselá hydrolýza: K 1 ml moči přidejte 0,25 ml HCl do zkumavky se šroubovacím uzávěrem. Uzávěr volně připevněte a zkumavku zahřívejte ve vroucí vodní lázni 60 minut. pH následně upravte na 7 (nebo dle potřeby) pomocí 1,0 N NaOH.

Tkáň

Homogenizujte s organickým nebo vodným rozpouštědlem v závislosti na rozpustnosti analytu. Nechte usadit, dekantujte, odstřeďte nebo filtrujte supernatant. Na tkáni proveďte přímou extrakci metodou Matrix Solid Phase Dispersion (MSPD).