Automated Sample Preparation for Profiling Fatty Acids in Blood and Plasma using the Agilent 7693 ALS

Význam tématu

Analýza profilu mastných kyselin v krvi a plazmě je nezbytným nástrojem v biomedicínském výzkumu, nutričních studiích i v lipidomice. Poskytuje klíčové informace o vztahu mezi příjmem lipidů, metabolickým stavem a rizikem kardiovaskulárních či jiných onemocnění. Minimalizace objemu vzorku a automatizace přípravy přispívají ke zvýšení reproducibility a propustnosti laboratoří.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo převést existující miniaturizovanou metodu derivatizace mastných kyselin na plně automatizovaný postup pomocí Agilent 7693 Automatic Liquid Sampler (ALS). Metoda zahrnuje transmethylaci lipidů v malém objemu (50 µl) krve či plazmy a následnou extrakci methylesterů mastných kyselin (FAME) do iso-oktanu. Výsledné extrakty jsou poté separovány a detekovány pomocí plynové chromatografie s FID detektorem.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda kombinuje derivatizaci, extrakci a GC-FID analýzu v jedné plně automatizované sekvenci:

• Vzorky: 50 µl krve nebo plazmy ve 250µl insertu.
• Derivatizace: 5% acetylchlorid v methanolu, inkubace při 75 °C (3×10 min míchání a zahřívání).
• Extrahující činidlo: 100 µl iso-oktanu, míchání, oddělení fází.
• Analýza: Agilent 7890 GC s HP-88 kolonkou (100 m × 0,25 mm, 0,2 µm), splitless 1 µl injekce, programová teplotní rampa od 50 °C do 250 °C, FID detekce.
• Automatizace: Agilent 7693A ALS se dvěma věžemi (10 a 100 µl stříkačky), podavač vzorků s vyhříváním a čtečkou čárového kódu.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosahuje vynikající opakovatelnosti: průměrné RSD pro relativní plochu sloupců mastných kyselin je 2 %, u abundentních složek (<0,5 %) obvykle pod 1 %. Overlay chromatogramů šesti po sobě následujících příprav ukazuje téměř dokonalou shodu. Vzorky plné krve vykazují vyšší podíl dlouhořetězcových nasycených a vícenenasycených kyselin (EPA, DHA) ve srovnání s plazmou.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizovaný postup s minimálním objemem vzorku výrazně zkracuje dobu přípravy, redukuje riziko chyb při manuální manipulaci a umožňuje vysokou propustnost analýzy. Je vhodný pro klinické studie, dietetické intervence, metabolomické projekty i rutinní QA/QC v potravinářském a farmaceutickém průmyslu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalším krokem může být integrace s hmotnostní spektrometrií pro detailní strukturové informace, využití zpětného vyplachování kolonek ke zkrácení doby analýzy, rozšíření automatizace o přímou přípravu vzorků z krve plné versus frakcionované a adaptace na 96jamkové mikrodestičky pro ultra vysokou propustnost.

Závěr

Převedením miniaturizované metody na plně automatizovaný postup s Agilent 7693 ALS byl dosažen vysoce reprodukovatelný protokol pro profilaci mastných kyselin v krvi a plazmě. Metoda vyžaduje pouze 50 µl vzorku, nabízí jednoduchou obsluhu a vysokou analytickou výkonnost, což otevírá cestu pro rozsáhlé klinické a výzkumné aplikace.

Reference

1. Hodson L., Murray Skeaff C., Fielding B.A. Progress in Lipid Research 47 (2008) 348–380
2. Marangoni F., Colombo C., Galli C. Analytical Biochemistry 326 (2004) 267–272
3. Bicalho B., David F., Rumplel K., Kindt E., Sandra P. Journal of Chromatography A 1211 (2008) 120–128
4. Milner C., Kinghorn R., Klee M.S. Agilent Technologies Application Note 5989-8588EN