Netěkavé N-nitrosaminy v pivovarství. Část I. - Vznik a metody stanovení

Na rozdíl od N-nitrosaminů těkavých je toho v pivovarství o nitrosaminech netěkavých, jejich hlavních představitelích a mechanismech vzniku, známo velmi málo.

V první části publikace věnované problematice netěkavých nitrosaminů jsou proto podány základní informace týkající se jejich výskytu, mechanismu vzniku a metod stanovení v pivu a ostatních potravinách.

1 ÚVOD

Současné poznatky o celkových N–nitrososloučeninách v pivu spolu s neustálým pokrokem v oblasti vývoje nových analytických instrumentálních metod umožňují podrobněji studovat jednotlivé zástupce tvořící tuto velmi různorodou skupinu látek. Členění nitrosaminů s ohledem na jejich fyzikálně-chemické vlastnosti a možnosti jejich výskytu v potravinách detailně popsal Tricker, 2000 a McWeeny, 1983. Zatímco skupinu těkavých N-nitrosaminů představují zejména N-nitrosodimethylamin (NDMA), N-nitrosodiethylamin (NDEA), N-nitrosodipropylamin (NDPA), N-nitrosodibutylamin (NDBA), N-nitrosopiperidin (NPIP), N-nitrosopyrrolidin (NPYR) a N-nitrosomorfolin (NMOR) a N-nitrosothiazolidin (NTHZ), skupinu netěkavých N-nitrosaminů tvoří kromě N-nitrososarkosinu (NSAR), N-nitrosoprolinu (NPRO) a N-nitrosohydroxyprolinu (NHPRO) i další N-nitrosované heterocyklické karboxylové kyseliny vzniklé kondenzací přítomných aminokyselin a jednoduchých aldehydů. Patří sem však též i N-nitrosované dipeptidy a polypeptidy a mnohé další látky. Mechanismus vzniku NSAR, NPRO a NHPRO v modelových roztocích studoval Janzowski et al., 1982.

Sloučeniny, jež zahrnujeme mezi ATNC, tvoří různorodou skupinu, přičemž o poměr ném zastoupení jednotlivých látek toho zatím příliš známo není. Dle údajů Walterse et al., 1983, mohou tuto skupinu kromě N-nitrosaminů tvořit i N-nitrosamidy, N-nitrosoguanidiny, N-nitrosourethany a N-nitrososulfonamidy. Ačkoli jsou do skupiny nitrosaminů řazeny kromě N-nitrosaminů i C-, O- a S-nitrosaminy (Williams, 1988), hlavní pozornost je věnována zejména N-nitrosaminům s ohledem na jejich nežádoucí zdravotní účinky. Jak vyplývá z mnohých dietetických studií zaměřených na studium podílu ATNC na vzniku rakoviny, lze považovat jejich podíl na tomto onemocnění za prokázaný (Mc Weeny, 1983, Stuff et al., 2009, Kuhnle et al., 2007, Buiatti et al.,2006, Lynn et al., 2009, Wu at al., 2006, Bingham et al., 2002).

S ohledem na výsledky získané na našem pracovišti v uplynulých letech se zdá být téměř jisté, že stejný obsah ATNC v pivech různých výrobců neznamená totožné složení přítomných ATNC. Detailní znalosti o zastoupení jednotlivých sloučenin tvořících ATNC by proto lépe umožnily odhadnout z toho vyplývající zdravotní riziko. V budoucnu by toto umožnilo porovnat skutečnou míru rizika plynoucí ze zjištěných hodnot u různých výrobců na rozdíl od současné praxe, porovnávající výhradně absolutní hodnoty obsahu ATNC.

2 PŘÍTOMNOST ATNC V POTRAVINÁCH A NÁPOJÍCH

Netěkavé N-nitrosované heterocyklické karboxylové kyseliny NSAR, NPRO a NHPRO se řadí do skupiny ATNC a jsou přítomny v různých potravinách, zejména v mase a tepelně opracovaných masných výrobcích (Hamburg, 2007, Drabik-Markiewicz et al., 2010, Tricker er al., 1985, Massey – Lees, 1992, Massey et al., 1991).

S přítomností ATNC se můžeme setkat i u fermentovaných mléčných výrobků (Massey – Key, 1989, Bouchikhi et al., 1999).

Sen et al., 1983 a Sen – Seaman, 1983, uvádějí obsah NPRO v pivu, rozmezí 0,7 až 6,0 μg/l, přičemž obsah NPRO ve sladu kolísal v rozmezí 5,0 až 113 μg/kg. NSAR nebyl ve sladu detekován. K obdobným závěrům dospěl i Pollock, 1981. Obsah NSAR ve sladu dosáhl dle autora hodnoty 20 μg/kg a NPRO 286 μg/kg. Obdobně Massey et al., 1990, stanovili přítomnost ATNC až u 42 % ze 170 zkoumaných vzorků komerčních piv. Maximální obsah ATNC činil 569 μg (N-NO)/kg.

Ačkoli Ministry of Agriculture, Fisheries and Food, 1992 (MAFF) publikovalo údaje svědčící o neustále sestupném trendu v pozorovaných obsazích ATNC v pivu, v roce 1992 se hodnoty obsahu ATNC v britských pivech pohybovaly v rozmezí <20 až 570 μg (N-NO)/kg. Příjem ATNC z piva při průměrném obsahu 54 μg (N-NO)/kg činil dle MAFF až 50 % z celkového denního příjmu. Pro porovnání, v pivech plzeňského typu různých výrobců kolísal dle našich poznatků v roce 1997 obsah ATNC v rozmezí <20 až 267 μg (N-NO)/kg, v roce 1998 v rozmezí <10 až 390 μg (N-NO)/kg a v roce 1999 v rozmezí <10 až 230 μg (N-NO)/kg.

Proto jsme se v této práci pokusili o podrobnější studium zastoupení jednotlivých látek spadajících do skupiny ATNC v pivech plzeňského typu.

Doposud doporučený limit obsahu ATNC v pivu platí zatím pouze ve Velké Británii a činí 20 μg N-NO/l.

3 ANALYTICKÉ METODY STANOVENÍ ATNC A NETĚKAVÝCH N-NITROSAMINŮ A JEJICH OBSAH V PIVU A SLADU

Způsob, jakým jednotliví autoři přistupují ke stanovení ATNC, je velmi odlišný. Důvodem je současný neuspokojivý stav poznání, jaké látky tuto skupinu převážně tvoří. Většina metod zaměřených na stanovení celkového množství nitrososloučenin v pivu pracuje na principu metody publikované Waltersem et al., 1978. Tato metoda spočívá na chemickém rozkladu N-NO skupiny obsažené v molekule sloučenin působením roztoku HBr v kyselině octové. Uvolněný nitrosylbromid, případně oxid dusnatý, je následně stanoven přímo kolorimetricky nebo po katalytickém rozštěpení na nitrosylový radikál chemiluminiscenčním detektorem. Detailně byla metoda a postup popsána a modifikována Waltersem et al.,1983.

Kromě dnes již téměř zapomenuté metody stanovení ATNC pomocí Griessova činidla (Dikun, 1976) se v běžné praxi setkáváme převážně s metodami využívajícími rozklad N-NO skupiny pomocí HBr v ledové kyselině octové (Massey et al. 1984a,b, Walters et al. 1984). Uvolněný oxid dusnatý, respektive nitrosylový radikál je dále stanoven chemiluminiscenčním detektorem TEA (Thermo Energy Analyser). Společnou nevýhodou výše uvedených metod je neschopnost rozlišit od sebe jednotlivé stanovené analyty a určit jejich podíl na celkovém stanoveném obsahu ATNC. O jisté řešení tohoto problému se pokusili proto Sen a Seaman, 1983, kteří využili ke stanovení ATNC spojení vysokoúčinné kapalinové chromatografie a chemiluminiscenčního detektoru (HPLC-TEA). V tomto případě jsou frakce obsahující jednotlivé zástupce ATNC přivedeny z HPLC do reakční baňky, kde refluxuje směs ethylacetátu a 15% roztoku HBr v kyselině octové. Nitrososkupina je odštěpena a po reakci s ozonem následně detekována detektorem TEA. Tento princip štěpení byl poprvé použit Eisenbrandem a Preussmannem, 1970, a později Waltersem et al., 1979, a Massey et al., 1990.

Rozsáhlé spektrum těkavých i netěkavých nitrosaminů tvořících určitou část ATNC lze též stanovit metodami využívajícími v prvním stupni denitrosaci pomocí směsi HBr – kyselina octová, avšak významně se lišícími vlastní analytickou koncovkou. Na rozdíl od předešlých metod jsou zde však stanoveny vznikající aminy (Wang et al., 1992, Zheng et al., 1993, Fu et al., 1993).

Havery, 1990, navrhl postup spočívající v dělení jednotlivých nitrosaminů pomocí HPLC, post-kolonové denitrosaci N-nitrososloučenin pomocí směsi 10 % H₂SO₄ a octové kyseliny a 10 % vodného roztoku KJ a následné detekci vznikajícího oxidu dusnatého pomocí TEA. Touto metodou již byl stanoven kromě těkavých N-nitrosaminů i netěkavý N-nitrosamin N-nitrosoprolin.

Denitrosaci lze dle Wanga et al., 2005, provést i pomocí roztoku CuCl v 6N HCl.

Možností stanovit netěkavé N-nitrosaminy voltamperometrickou detekcí ve spojení s HPLC se zabývá též práce Sachetta et al., 1992. Stanovením netěkavých N-nitrosaminů, zejména N-nitrosoaminokyselin, se zabývali převážně autoři pracující v oblasti potravinářské chemie. První pokus o systematické stanovení N-nitrosoprolinu (NPRO) a N-nitrososarkosinu (NSAR) ve sladu pomocí jejich extrakce ethylacetátem, derivatizací diazomethanem a stanovením na přístrojovém spojení GC-TEA učinil Pollock, 1981. Obdobný postup i způsob detekce zvolili Sen et al., 1983, kteří k extrakci použili opět ethylacetát, ale k derivatizaci směs BF3 – methanol. Johnson et al., 1988a naproti tomu použili k derivatizaci silylační činidlo bis(trimethylsilyl) trifluoroacetamid (BSTFA).

O odlišení jednotlivých představitelů ATNC v pivu se pokusili Massey et al., 1982. Netě kavé N-nitrosaminy byly extrahovány v kyselém a neutrálním prostředí pomocí speciální kolonky (Preptube) a stanoveny pomocí spojení HPLC-TEA. Obdržené chromatogramy se od sebe podstatně lišily, nicméně přístrojové vybavení neumožnilo, s výjimkou NPRO, jejich kvalita tivní a kvantitativní vyhodnocení. Přehled metod použitelných pro stanovení netěkavých N-nitrosaminů uvádí Sen a Kubacki, 1987. Pokroky v oblasti kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie umožnily detekovat další dosud neznámé zástupce netěkavých N-nitrososloučenin v potravinách (Tricker et al., 1984, Cheng – Tsang, 1999, Crews, 2010).

4 MECHANISMUS VZNIKU NITROSOSLOUČENIN V PIVU A SLADU

N-nitrosaminy vznikají obecně působením nitrosačního činidla. V zásadě se jedná o substituci vodíkového atomu dislokovaného na dusíkovém atomu amino- nebo amidoskupiny nitrososkupinou. Na rozdíl od obecně rozšířeného mylného názoru, že vlastním nitrosačním činidlem je NO– skupina nebo kyselina dusitá, lze pokládat za skutečné nitrosační činidlo N2O3 případně protonizovanou formu kyseliny dusité (Shuker, 1988, Smith, 1991).

Poměr v obsahu jednotlivých nitrosačních činidel je závislý na pH (Shuker, 1988), přičemž v oblasti pH nižší než 2 převládá přítomnost H₂NO₂⁺, zatímco při pH vyšším než 3 dominuje N2O3. Nicméně v oblasti pH 2 až 5 jsou oba ionty přítomny v detekovatelném množství. Je tedy zřejmé, že hodnota pH mladiny a piva má spolu s koncentrací neprotonizovaného aminu rozhodující vliv na množství vznikajících nitrosaminů. Vznik zbývajících dvou nitrosačních činidel nepřichází za standardních podmínek, s ohledem na reakční podmínky v pivu, prakticky v úvahu.

Základní cestou umožňující N-nitrosaci v pivovarství jsou asimilační metabolické procesy u divokých kvasinek (Brown et al., 1974, Cole, 1988, Garrett-Amy, 1979, Smith, 1992) a disimilační procesy probíhající při anaerobním dýchání u kontaminujících fakultativních anaerobů (Cole, 1988, Garrett-Amy, 1979, Ingledew-Poole, 1984, Moodie-Ingledew, 1990, Stouthamer, 1976, Smith et al., 1992). Výskyt ATNC v pivu lze tudíž považovat za projev nedokonalé mikrobiální čistoty výrobního procesu (Caldebrank-Hammond, 1989). Metodami pro zkoumání přítomnosti volného a vázaného NPRO na bílkoviny piva se zabývali Johnson et al., 1988b. Studiem mechanismu vzniku ATNC ve sladu se zabývali Pollock, 1981 a Johnson et al., 1987.

5 MATERIÁLY A METODY

Chemikálie

Všechny použité chemikálie, tj. ethylacetát, hydroxid draselný, kyselina octová, kyselina sírová, kyselina chlorovodíková, kyselina sulfanilová, amidosulfonan draselný, byly čistoty p.a. Bromovodík p.a. pocházel od firmy Sigma – Aldrich. Sorbent Extrelut 20 byl dodán firmou (Merck, Germany). SPE kolonky SAX Bond Elute, 3 ml byly dodány firmou Analytichem International Inc., USA. Standardy NPRO, NSAR a NPIC pocházely od firmy ISCONLAB (Heidelberg, Německo), NDMA od firmy Supelco. Ultračistá voda byla vyrobena na zařízení Milli-Q System (Millipore, USA). Technické plyny pro plynovou chromatografii argon, kyslík a dusík a pevný oxid uhličitý byly dodány firmou Messer (ČR).

Vzorky piv

Piva plzeňského typu cizí i tuzemské provenience byla zakoupena v běžné obchodní síti.

Analytický postup pro stanovení ATNC v pivu

Celkový obsah skupiny N-NO ve vzorku byl stanoven denitrosační metodou pomocí HBr a detekcí prostřednictvím detektoru TEA (Kellner et al., 1991).

Vzorek piva odpěníme na ultrazvukové lázni po dobu 5 až 10 minut. K 5 ml odplyněného piva přidáme 1 ml amidosulfonanu amonného (c= 0,2 mol/l) a 1 ml kyseliny sírové (c = 0,2 mol/l) a ponecháme 15 až 60 minut stát. Po této době je pivo zbaveno dusičnanů i dusitanů a připraveno k analýze. Kondicionaci kolonky SAX Bond Elute provádíme promytím 3 ml methanolu, 3 ml HCl (c = 0,01 mol/l) a sorbent krátce vysušíme pomocí vakua (5 s). Směs převedeme přes kondicionovanou kolonku pomocí vakua, přičemž první podíl filtrátu (cca 2 ml směsi) odstraníme.

Do tříhrdlé zábrusové baňky obalené izolační vrstvou (skelná tkanina – Al fólie) nadávkujeme 70 ml ethylacetátu, 10 ml denitrosačního činidla (15% hm. HBr v kyselině octové) a 2 g kyseliny sulfanilové. Směs je opatrně zahřívána pod zpětným chladičem (teplota směsi 64 °C ± 2 °C ) a kapilárou, která je postranním hrdlem zavedena ke dnu baňky, ponecháme jemně probublávat argon. Celá aparatura je hermeticky uzavřena a přes dvě promývačky naplněné 33% roztokem KOH, restriktor, dva vymrazovače (–80 °C, směs methanol a suchý led) spojené restriktorem a skleněný kapilární restriktor je napojena přes třícestný T-ventil na detektor. Po ustavení rovnováhy v aparatuře a po ustálení základní linie nastříkneme 200 μl standardu (c = 200 μg/l) postranním hrdlem, které je uzavřeno septem a zahájíme analýzu. Dále nastříkneme 200 μl vzorku. Následuje nástřik slepého vzorku. Měření vzorku uzavírá opět měření standardu.

Analytický postup pro stanovení netěkavých N-nitrosaminů (NSAR, NPRO) v pivu

15 ml vzorku piva (neozářeného nebo ozářeného UV světlem) bylo smíšeno s 3 ml H₂SO₄ (c = 1,5 mol/l) a s 1 ml 1 % roztoku amidosulfonanu amonného (amonná sůl kyseliny amidosírové – H₂NSO₃NH₄). Přídavek amidosulfonanu amonného slouží v tomto případě k odstranění zbytkových množství dusitanových iontů. Nitrosopipekolová kyselina (NPIC, 1-nitrosopiperidin-2-karboxylová kyselina) byla použita jako interní standard (15 μl, c = 100 mg/l).

Do skleněné kolony (délka 18 cm, vnitřní průměr 2 cm) opatřené fritou nejprve nasypeme 5 mm vrstvu bezvodého síranu sodného a dále za stálého poklepávání přidáme 12 g sorbentu Extrelut 20 (Merck). Upravený vzorek piva zvolna převedeme na naplněnou kolonu a ponecháme 15 minut vsáknout. Po uplynutí této doby nitrosoaminokyseliny extrahujeme 4 × 20 ml ethylacetátu. Extrakt zahustíme na vakuové odparce na přibližný objem 2 ml a koncentrát kvantitativně převedeme do kalibrované nádobky. Residua koncentrátu vypláchneme přídavkem 2 ml ethylacetátu. V kalibrované nádobce koncentrát zahustíme proudem dusíku na konečný objem 200 μl.

Organický extrakt (200 μl), respektive roztok standardu v ethylacetátu, smísíme v reakční nádobce s 1 ml derivatizačního roztoku BF3 – MeOH. Nádobku uzavřeme a směs ponecháme reagovat v temnu po dobu 30 minut při teplotě 65 ± 5 °C. Po ochlazení zbytek derivatizačního činidla odstraníme přídavkem 4 ml redestilované vody. Vzniklé methylestery nitrosoaminokyselin dále vytřepáme do 1 ml dichlormethanu a po oddělení dichlormethanovou vrstvu vysušíme přídavkem bezvodého síranu sodného. Takto získané methylestery lze před vlastním stanovením přechovávat při teplotě – 18 °C po dobu jednoho týdne. Obsah analytů stanovíme pomocí přístrojového spojení plynového chromatografu a chemiluminiscenčního detektoru (GC – TEA). Použití widebore kapilární kolony BD-5 o vnitřním průměru 0,53 mm a tloušťce filmu stacionární fáze 1,5 μm umožnilo, díky vysoké kapacitě kolony, nástřik až 5 μl vzorku na kolonu. Důsledkem toho byla dosažena uspokojivá citlivost metody.

Podmínky plynové chromatografie

Plynový chromatograf Fisons 8000 Ultra. Fused silica kapilární kolona DB-5 (délka 30 m, ID 0,53 mm, 1,5 μm), Supelco, U.S.A. Teplota injektoru vybaveného wide bore linerem činila 200 °C. Objem nástřiku 5 μl. Nosný plyn argon, průtok 25 ml/min. Teplotní program pece: 80 °C (1 min) – 3,5 °C /min – 150 °C (10 min). Teplota spojení GCTEA činila 230 °C

Detektor TEA 502 A byl na vstupu opatřen CTR filtrem (Thermo Electron Corp., USA). Teplota pyrolyzní pece 485 °C. Průtok kyslíku 20 ml/min. Vakuum – 80 Pa (0,6 torr resp. mm Hg). Průtok nosného plynu argonu činil 25 ml/min.

Výtěžnost metody byla ověřena metodou standardního přídavku a činila u NSAR 55,3 %, NPRO 63,0 % a NPIC 133 %. S ohledem na přibližně poloviční výtěžnost u NSAR a NPRO v porovnání s interním standardem byly proto veškeré výsledky získané metodou vnitřního standardu odpovídajícím způsobem korigovány. Chromatogram obohaceného vzorku piva přídavkem NSAR, NPRO a NPIC na koncentraci 100 μg/l každé látky je znázorněn na obr. 1.

Obr. 1 Chromatogram obohaceného vzorku piva přídavkem NSAR, NPRO a NPIC (100 μg/l každé látky)

Odezva detektoru TEA byla v používaném rozsahu koncentrací 0 až 100 μg/l lineární.

Mez stanovení činila u NSAR, NPRO a NPIC 1 μg/l.

Obsah NDMA byl stanoven standardní metodou pomocí spojení GC-TEA (Spiegehalder et al., 1983, Čulík et al., 1989).

6 ZÍSKANÉ VÝSLEDKY A DISKUSE

Navržený extrakční postup s využitím sorbentu Extrelut 20 odstranil problémy s tvor bou emulze, ke které dochází v případě klasické extrakce v systému kapalina-kapalina. Maximální objem zpracovávaného vzorku 15 ml lze považovat za dostačující, i když by bylo s ohledem na stopová množství stanovených látek vhodnější zpracovávat větší objem vzorku. Kapacita sorbentu to však neumožňuje. Určitou možností by bylo paralelní zpracování vzorku na více kolonách s následným spojením extraktů a jejich koncentrováním. Pro naše účely však postačovalo zpracování 15 ml piva.

Na základě porovnání výsledků výtěžností NSAR, NPRO, které jsou nižší než výtěž nosti vnitřního standardu NPIC, lze usuzovat, že mohou být tyto sloučeniny, s ohledem na jejich rozdílnou polaritu, vázány na povrchu sorbentu Extrelut 20 s rozdílnou intenzitou, například v důsledku interakce s přítomnými silanolovými skupinami.

Stanovení methylesterů N-nitrosoaminokyselin metodou kapilární plynové chromatografie s detektorem TEA lze považovat za citlivé a selektivní. Dělení analytů na použité koloně bylo, jak v případě standardů, tak i reálného vzorku piva obohaceného přídavkem N-nitrosoaminokyselin, uspokojivé. Výhodou použití widebore kapilární kolony je, kromě výše uvedených předností, i krátký čas analýzy, který činil v našem případě 20 minut.

Ve zkoumaných vzorcích komerčních piv nebyla potvrzena přítomnost NSAR. Množství stanoveného NPRO se pohybovalo v úzkém rozmezí < 1 až 11 μg/l. Obsah NPRO překročil hranici 10 % celkového obsahu ATNC pouze ve výjimečných případech (tab.1). Získané poznatky korespondují s dříve publikovanými údaji (Massey et al., 1990, Johnson et al., 1988b).

Tab. 1 Obsah NDMA, NSAR, NPRO ve vzorcích komerčních piv různých výrobců

• ND = pod mezí stanovení ( NDMA < 0,1 μg/l, NSAR, NPRO < 1,0 μg/l )
• • = obsah NPRO stanoven pomocí GC-TEA a vyjádřen jako ATNC

Nebyl zjištěn vzájemný vztah mezi obsahem NPRO a obsahem ATNC. To potvrzuje předpoklad, že se složení ATNC u piv jednotlivých výrobců může podstatně lišit.

Vzhledem k tomu, že většina nitrosaminů vykazuje kancerogenní účinky, zdá se být požadavek na jejich co nejnižší obsah v potravinách oprávněný a další výzkum na tomto poli žádoucí.