Síla GCxGC-HRTOFMS: Charakterizace metabolitů kvasinek

V úsilí porozumět biologii na molekulární úrovni představuje metabolomika jeden ze základních pilířů systémové biologie. Umožňuje sledovat, jak organismy reagují na genetické, environmentální a fyziologické změny prostřednictvím komplexního profilování malých molekul. Již desítky let slouží kvasinka Saccharomyces cerevisiae jako klíčový modelový organismus – ať už ve vinařství, výrobě bioethanolu nebo jako platforma pro průmyslové bioinženýrství.

Aby však bylo možné plně využít potenciál metabolicky modifikovaných systémů, potřebují výzkumníci přesné, komplexní a vysoce přesné analytické nástroje pro charakterizaci široké škály metabolitů v komplexních biologických matricích. Právě zde přichází na scénu systém Pegasus® HRT 4D společnosti LECO – transformační platforma kombinující dvourozměrnou plynovou chromatografii (GCxGC) s hmotnostní spektrometrií s analyzátorem doby letu (HRTOF-MS). Tato výkonná kombinace výrazně zvyšuje chromatografické rozlišení i spektrální čistotu a tím zvyšuje jistotu identifikace a anotace sloučenin při výzkumu metabolických procesů.

LECO: Pegasus GC-HRT+ 4D

Profilování metabolitů z kvasinek

Ve studii prezentované v aplikační poznámce společnosti LECO byl systém Pegasus HRT 4D použit k profilování metabolitů z autolyzátu kvasinek. Dva extrakty kvasinek byly obohaceny směsí interních standardů složenou z deuterovaných a ¹³C značených reprezentativních sloučenin. Vzorky následně prošly dvoustupňovou derivatizací (methoximace a silylace) před nástřikem do GC systému.

Měření probíhalo v režimu jednorozměrné (1D) i dvourozměrné (2D) GC s elektronovou ionizací (EI) i chemickou ionizací (CI), což umožnilo velmi přesnou identifikaci sloučenin s přesností hmotnosti pod úrovní ppm. Vyhledávání píků a dekonvoluce pomocí softwaru ChromaTOF® odhalily derivatizované metabolity z mnoha tříd látek, včetně organických kyselin, dikyselin, aminokyselin, sacharidů, dusíkatých bází, nukleosidů a nukleotidů.

LECO: Reprezentativní sloučeniny v autolyzátu kvasinek.

Klíčová zjištění

Zlepšená spektrální shoda:

• Záznam dat v režimu GCxGC výrazně zvýšil skóre shody se spektrálními knihovnami.

LECO: Srovnání skóre spektrální podobnosti získaných z dat GC a GCxGC-HRT z extraktu pekařských kvasinek. Čistší spektra získaná pomocí GCxGC mají významný vliv na skóre podobnosti knihovny.

Vysoká přesnost hmotnosti:

• Molekulární i fragmentové ionty byly identifikovány s mimořádnou přesností – průměrná chyba hmotnosti byla <1 ppm u souboru přirozených i izotopicky značených aminokyselin.

Vyšší kapacita píků a lepší rozlišení:

• Technologie High Resolution Deconvolution® (HRD®) umožnila spolehlivou detekci koelujících přirozených i izotopicky značených metabolitů a jejich jasné rozlišení v komplexních směsích.

LECO: A) XIC B) Spektrum skutečné hmotnosti píku pro nativní tryptofan (3TMS) C) Hmotnostní spektrum tryptofanu (3TMS) z knihovny NIST

Špičkový nástroj pro metabolomický výzkum

Robustní výkon platformy vychází z integrace vysoké rychlosti akvizice (až 200 spekter/s v režimu GCxGC), detekce s přesnou hmotností a intuitivního zpracování dat prostřednictvím softwaru ChromaTOF – vše v rámci jednoho efektivního pracovního postupu.

Systém Pegasus HRT 4D poskytuje výzkumníkům rozlišení, přesnost a flexibilitu ionizace potřebné pro spolehlivou interpretaci metabolických profilů živých systémů. Ať už jde o studium biomarkerů onemocnění, dopadů genetických modifikací nebo optimalizaci fermentačních procesů, kombinace separace GCxGC a HRAM TOF-MS nabízí výraznou výhodu v necílené metabolomice.

Díky přístrojům, jako je Pegasus GC-HRT 4D, jsou workflow pro objevování metabolitů méně náročná a výrazně časově efektivnější. Pokud se chcete dozvědět více o studii charakterizace metabolitů kvasinek, doporučujeme prostudovat aplikační poznámku společnosti LECO nebo zhlédnout nejnovější webinář věnovaný možnostem systému Pegasus GC-HRT 4D v oblasti metabolomiky.